ОЛИГОПЕПТИД №49 — Для лечения атеросклероза

В основе молекулярного механизма развития атеросклероза лежит снижение экспрессии сигнальных молекул (Сх37, Сх40) коннексина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и пролиферативного белка Ki-67, характеризующих процессы межклеточных взаимодействий и пролиферацию эндотелиоцитов (сосудистых клеток) сосудов. Комплекс №49 в концентрациях 4 и 40 мкг/мл способствовал восстановлению экспрессии маркеров Сх37, Сх40, VEGF в культуре эндотелиоцитов аорты, полученной от пациентов с атеросклерозом, что указывает на его вазопротективные свойства.

Одним из наиболее распространенных видов сердечно-сосудистой патологии является атеросклероз, лежащий в основе ишемических болезни сердца и др., в виде облитерирующих заболеваний нижних конечностей, инсульта, инфаркта миокарда и хронической сердечной недостаточности. Существующие лекарственные препараты зачастую лишь нивелируют симптомы атеросклероза, но не оказывают таргетного фармакологического действия на ключевые звенья патогененза заболевания. В связи с этим для разработки новых эффективных средств в борьбе с атеросклеротическим поражением сосудов необходимо понимание основ его патогенеза.

Важной проблемой патогенеза атеросклероза является молекулярная характеристика эндотелия сосудов (внутренней выстилки сосудов), которая активно вовлекаетсяв нарушение метаболизма основного вещества и белков (эластина, коллагена) в сосудистой стенке. Эти изменения могут возникать даже на ранних стадиях атеросклеротического процесса, предшествуя накоплению липидов в стенке артерий. Одним из ключевых сигнальных молекул сосудистой стенки и ее патологии являются коннексины (Сх), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)и пролиферативный белок Ki-67.

Коннексины представляют собой мембранные белки, образующие канал, осуществляющий молекулярные взаимодействия между клетками. Коннексины являются тканеспецифичными белками: для сердечно-сосудистой системы характерными белками этой группы являются Сх37 и Сх40. С Сх43 взаимодействуют киназы (3-катенин, дребрин, тубулин, кавеолин-1 и др.). белок дребрин взаимодействует с коннексинами и с микрофиламентами, что указывает на взаимосвязь каналов и организацией цитоскелета клетки. Известно, что мутации в генах, кодирующих Сх40, могут лежать в основе сердечно-сосудистой патологии. Показано, что повышенная экспрессия Сх40, сопутствующая операции на сердце, может являться предвестником послеоперационной фибрилляции предсердий.

Транскрипционный фактор Ki-67 является маркером пролиферативной активности клеток. Пациенты с атеросклерозом аорты и артерий нижних конечностей имеют высокий уровень пролиферативной активности по сравнению с пациентами без атеросклероза. Пролиферативная активность эндотелиальных и гладкомышечных клеток стенки аорты, агрессивность и активность атеросклероза у больных с тромботическими реокклюзиями в отдаленном послеоперационном периоде превышает таковую у больных без тромбозов и способствует наступлению данного осложнения после операции.

Другой сигнальной молекулой – маркером развития атеросклероза является VEGF, который индуцирует пролиферацию клеток эндотелия и сосудистую проницаемость.

Целью экспериментальной работы являлось изучение влияния пептидного пула комплекса №49 на экспрессию сигнальных молекул – маркеров межклеточных взаимодействий и пролиферативной активности в клетках эндотелия сосудов с атеросклерозом.

Методика исследования. Материал аорты без патологических изменений был получен от эмбриона человека (21 недели гестации) в НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отто РАМН. Ткань атеросклеротической аорты человека (и фрагмента диаметром 0,2 см) была получена при операции аортокоронарного шунтирования. Материал брали в стерильных условиях и помещали в стерильную емкость с физиологическим раствором.

Путем ферментативной диссоциации (коллагеназа) из материала аорты была получена первичная культура ткани эндотелия. Выделение первичной культуры проводилось на чашках Петри («Sarstedt»), обработанных раствором фибриногена («Gibco»); последующее культивирование проводилось во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (25 см2, «Sarstedt»).

Среда для культивирования клеток содержала 87,5 М199, 10% фосфатно-солевого буфера, 1,5% HEPES, 1% PES (phe-nazine ethosulfate) и L-глутамин.

Пассирование клеток проводили через 3-е суток на 4-е, посевная концентрация составляла примерно 3×105 клеток на флакон. Культивирование проводили до 3-го пассажа (для эндотелия, пораженного атеросклерозом) и до 7-го пассажа (для нормального эндотелия), на которых клетки рассеивали на 24-луночный планшет для иммуноцитохимического окрашивания.

Все культуры (нормального и пораженного атеросклерозом эндотелия) были разделены на 3 группы:

• Контроль (без введения пептидного комплекса №49).
• С добавлением пептидного комплекса №49 в концентрации 4 мкг/мл.
• С добавлением пептидного комплекса №49 в концентрации 40 мкг/мл.

Для иммуногистохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к маркерам Сх37 (1:20; «Abgent»), Сх40 (1:100; «Abeam»), VEGF (1:50; «Dako»), Ki-67 (1:50; «Dako») и вторичные антитела – биотинилированные антисышечные иммуноглобулины. Пермеабилизацию проводили с применением 0,5% Тритона Х-100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина («En Visiоn Detection Sistem», Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Результаты иммуноцитохимического окрашивания оценивали морфологическим методом на микроскопе «Nikon Eslipse» Е400 с помощью цифровой камеры «Nicon» DXM 1200 и программного обеспечения «Videotest Morphology 5.2». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200. Площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах.

Статистическую обработку полученных данных проводили в программе «Statistica 7.0». Для сравнения и оценки Межгрупповых различий использовали не параметрический U-критерий Манна-Уитни, который является наиболее точным методом для сравнения выборок, включающих около 10-15 элементов. Различия считали статистически значимыми при р<0,5.

Результаты исследования. В культурах клеток эндотелия сосудов, полученных от здоровых доноров, экспрессия маркеров VEGF, Cx37, Cx40 b Ki-67 была в 3-25 раз выше по сравнению с соответствующими показателями для эндотелиоцитов, полученных от пациентов с атеросклерозом.

В культуре клеток эндотелия здоровых доноров исследуемый комплекс №49 способствовал достоверному увеличению только одного из исследуемых маркеров – Сх37, и не влиял на экспрессию белков VEGF, Сх40 и Ki-67. Однако, комплекс №49 оказывал выраженное протективное действие на культуру эндотелиоцитов, полученных от пациентов с атеросклерозом. Так, при атеросклерозе под действием пептидного пула комплекса №49 в концентрациях 4 и 40 мкг/мл экспрессия VEGF в клетках сосудов возрастала в 2 и 3 раза соответственно по сравнению с контролем.

Интересно, что в зависимости от концентрации пептидов изменялось их влияние на экспрессию Сх37 и Сх40 культуре эндотелиоцитов, полученных от больных с атеросклеротическим поражением сосудов. Пептиды в концентрации 4 мкг/мл стимулировали повышение экспрессии Сх40 в 2,3 раза по сравнению с контролем, но не влияли на экспрессию Сх37, тогда как в концентрациях 40 мкг/мл эти пептиды вызывали увеличение экспрессии Сх37 в 1,9 раза по сравнению с контролем, но не влияли на синтез Сх40. При этом пептиды в обеих исследуемых концентрациях не влияли на экспрессию пролиферативного белка Ki-67 в клетках эндотелия, полученных от пациентов с атеросклерозом.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в основе молекулярного механизма атеросклеротического поражения сосудов лежит снижение экспрессии ряда сигнальных молекул, участвующих в межклеточных взаимодействиях эндотелиоцитов (Сх37 и Сх40), ангио- и васкулогенезе (фактор VEGF) и пролиферации (транскрипционный фактор Ki-67).

Исследуемый пептидный пул комплекса №49, с одной стороны, не влияет на экспрессию сигнальных молекул в нормальном эндотелии, а с другой — способствует значительному повышению сниженной при атеросклерозе экспрессии указанных сигнальных молекул.

Таким образом, пептидный пул комплекса №49, способствующий восстановлению межклеточных взаимодействий и неоваскулогенезу, является перспективным средством для таргетной терапии атеросклеротического поражения сосудов, ишемической болезни сердца, инсульта и инфарктамиокарда.